Nhuộm Gram: Nguyên tắc, quy trình, diễn giải 2023

Nhuộm Gram là một trong những kỹ thuật nhuộm quan trọng nhất trong vi sinh vật học. Nó được đặt tên từ nhà vi khuẩn học người Đan Mạch Hans Christian Gram, người lần đầu tiên giới thiệu nó vào năm 1882, chủ yếu để xác định các sinh vật gây ra bệnh viêm phổi. Khi thử nghiệm đầu tiên được thực hiện, phương pháp nhuộm gram vi khuẩn bao gồm việc sử dụng tinh thể tím hoặc xanh methylen làm màu chính.

Thuật ngữ chỉ các sinh vật giữ được màu cơ bản và xuất hiện màu nâu tím dưới kính hiển vi là sinh vật Gram dương. Các sinh vật không bắt màu sơ cấp có màu đỏ dưới kính hiển vi và là các sinh vật Gram âm. Để hiểu rõ hơn về phương pháp này, hãy cùng Doctor có sẵn tìm hiểu thêm trong nội dung dưới đây.

Bài viết được tham khảo ý kiến chuyên môn của Bác sĩ Trần Diễm Hương

Tổng quan về phương pháp nhuộm Gram

Bước đầu tiên trong quá trình nhuộm Gram là sử dụng thuốc nhuộm tím pha lê để nhuộm ban đầu cho phiến kính. Bước tiếp theo, còn được gọi là cố định thuốc nhuộm, bao gồm việc sử dụng i-ốt để tạo thành phức hợp i-ốt màu tím tinh thể để ngăn cản việc loại bỏ thuốc nhuộm một cách dễ dàng.

Sau đó, một chất khử màu, thường là dung môi của etanol và axeton được sử dụng để loại bỏ màu nhuộm. Nguyên tắc cơ bản của nhuộm Gram liên quan đến khả năng của thành tế bào vi khuẩn để giữ lại thuốc nhuộm tím tinh thể trong quá trình xử lý bằng dung môi. Vi sinh vật gram dương có hàm lượng peptidoglycan cao hơn, trong khi vi sinh vật gram âm có hàm lượng lipid cao hơn.

Ban đầu, tất cả các vi khuẩn sử dụng thuốc nhuộm màu tím pha lê tuy nhiên, với việc sử dụng dung môi, lớp lipid từ các sinh vật gram âm bị hòa tan. Với sự hòa tan của lớp lipid, gram âm làm mất vết sơ cấp.

Ngược lại, dung môi làm mất nước của thành tế bào gram dương với việc đóng các lỗ chân lông ngăn cản sự khuếch tán của phức hợp iốt tím và do đó, vi khuẩn vẫn bị nhuộm màu. Thời gian khử màu là một bước quan trọng trong quá trình nhuộm gram vì tiếp xúc lâu với chất khử màu có thể loại bỏ tất cả các vết bẩn khỏi cả hai loại vi khuẩn.

Bước cuối cùng trong quá trình nhuộm gram là sử dụng chất nhuộm màu fuchsin cơ bản để tạo cho vi khuẩn gram âm đã khử màu có màu hồng để dễ nhận biết hơn. Nó còn được gọi là phản lưới. Một số phòng thí nghiệm sử dụng safranin như một chất phản công tuy nhiên, fuchsin cơ bản nhuộm các sinh vật gram âm mạnh hơn safranin. Tương tự, ứng dụng Haemophilus spp., Legionella và một số vi khuẩn kỵ khí bắt màu kém với safranin.

Quy trình nhuộm Gram tại phòng khám như thế nào?

Khi nào cần chỉ định nhuộm Gram

Nhuộm Gram được chỉ định bất cứ khi nào nghi ngờ nhiễm vi khuẩn để chẩn đoán sớm và dễ dàng. Từ việc phân định vi khuẩn, bác sĩ có thể chẩn đoán được chính xác nguyên nhân cũng như cách điều trị phù hợp, hiệu quả cho bệnh nhân. Việc tiến hành nhuộm Gram cần thực hiện nhanh chóng cũng như theo đúng quy trình để nhận được kết quả chính xác nhất.

Mẫu vật

Nhiều bệnh phẩm lâm sàng khác nhau có thể được sử dụng để thực hiện nhuộm Gram vi khuẩn. Một số bệnh phẩm thường được sử dụng là đờm, máu, dịch não tuỷ, dịch cổ trướng, dịch khớp, dịch màng phổi, nước tiểu,… Cũng có thể dùng tăm bông ngoáy mũi, họng, trực tràng, vết thương, cổ tử cung. Việc lấy bệnh phẩm phải luôn được đựng trong các vật chứa vô trùng.

Các bước nhuộm Gram

Các loại thiết bị cần thiết để nhuộm Gram

• Đầu đốt Bunsen
• Kính hiển vi làm sạch bằng cồn
• Giá trượt
• Kính hiển vi

Thuốc thử cần thiết để nhuộm Gram

• Màu tím pha lê (vết chính)
• Dung dịch iốt Gram (chất kết dính)
• Axeton / etanol (50:50 v: v) (chất khử màu)
• Dung dịch fuchsin cơ bản 0,1% (chất cản quang)
• Nước

Thực hiện

Chuẩn bị phết tế bào

• Vòng cấy được sử dụng để chuyển một giọt dịch nuôi cấy lơ lửng vào lam kính hiển vi. 
• Nếu đĩa Petri hoặc ống nuôi cấy nghiêng có khuẩn lạc thì một giọt hoặc một vài vòng nước được thêm vào để tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển một lượng khuẩn lạc tối thiểu vào phiến kính kiểm tra. 
• Yêu cầu một lượng nuôi cấy tối thiểu. Nếu mẫu cấy có thể được phát hiện bằng mắt thường trên vòng cấy, điều đó cho thấy việc thu thập quá nhiều mẫu cấy.
• Nuôi cấy được trải bằng một vòng cấy vào một màng mỏng đều trên một vòng tròn có đường kính 15mm. Một phiến kính điển hình có thể chứa tối đa 4 vết bẩn nhỏ nếu kiểm tra nhiều hơn một mẫu cấy.
• Bản chiếu có thể được làm khô bằng không khí hoặc làm khô với sự trợ giúp của nhiệt trên ngọn lửa nhẹ. Slide phải được di chuyển theo hình tròn trên ngọn lửa để tránh quá nhiệt hoặc hình thành các mẫu vòng trong slide. Nhiệt giúp kết dính tế bào vào lam kính và ngăn ngừa sự mất mát đáng kể của chất nuôi cấy trong quá trình rửa.

Nhuộm Gram

Quy trình nhuộm Gram gồm các bước như sau:

• Dàn tiêu bản: Nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên lam kính. Lấy vi khuẩn từ các môi trường đã nuôi cấy hoặc từ dịch tiết của cơ thể bằng que cấy sau đó dàn đều trên lam kính với nước muối sinh lý.
• Cố định mẫu bệnh phẩm bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội. Mục đích là để giết chết vi khuẩn, giúp vi khuẩn gắn chặt vào lam kính và bắt màu thuốc nhuộm tốt hơn.
• Thêm thuốc nhuộm tím pha lê vào vùng có vi khuẩn trên lam kính trong thời gian 30 – 60 giây, vết bẩn sẽ được đổ ra và rửa sạch bằng nước.Mục đích là rửa sạch vết bẩn mà không làm mất đi lớp cấy cố định đồng thời để vi khuẩn thấm đều màu thuốc nhuộm.
• Tiếp theo phủ dung dịch Lugol để cố định màu hay còn gọi là “cố định thuốc nhuộm”, cũng để khoảng 10-60 giây rồi rửa dưới vòi nước. Dung dịch sẽ giúp gắn màu tím vào vi khuẩn đậm hay nhạt tùy thuộc vào loại của nó, giúp vi khuẩn giữ màu thuốc nhuộm tím tốt hơn.
• Tẩy màu bằng một vài giọt chất khử màu thêm vào lam,giữ trong 30 giây hoặc tẩy đến khi thấy mất màu sau đó rửa đuổi dưới vòi nước.Chất khử màu thường là dung môi hỗn hợp của etanol và axeton. Bước này được gọi là “xử lý dung môi”. Để ngăn chặn sự khử màu quá mức trong các tế bào gram dương, hãy ngừng thêm chất khử màu ngay khi dung môi không có màu khi nó chảy qua phiến kính. 
• Cuối cùng, vết bẩn được trộn với dung dịch fuchsin cơ bản trong 40 đến 60 giây. Dung dịch fuchsin được rửa sạch bằng nước và nước thừa sẽ được thấm bằng giấy bibulous. Tấm trượt cũng có thể được làm khô bằng không khí sau khi rũ bỏ nước thừa.

Kiểm tra slide bằng kính hiển vi

• Các phiến kính phải được kiểm tra dưới kính hiển vi trong điều kiện ngâm trong dầu.
• Việc kiểm tra phiến kính ban đầu nên sử dụng vật kính X40 để đánh giá sự phân bố vết bẩn, và sau đó chúng nên được kiểm tra bằng vật kính ngâm dầu X100. Đọc kết quả nhuộm Gram:
  • Vi khuẩn gram dương có thành tế bào được cấu tạo chủ yếu từ một lớp được gọi là peptidoglycan. Các vi khuẩn này sẽ có màu tím sau khi nhuộm gram.
  • Vi khuẩn gram âm có thành tế bào gồm một lớp mỏng peptidoglycan và màng ngoài có lipopolysaccharide (thành phần này không có ở vi khuẩn gram dương. Vi khuẩn gram âm có màu đỏ hoặc hồng sau khi nhuộm gram.
• Tất cả các khu vực của slide yêu cầu kiểm tra ban đầu. Nên kiểm tra những vùng chỉ dày một ô. Các vùng dày trong các trang chiếu thường cho kết quả thay đổi và không chính xác. 
• Bạch cầu và đại thực bào nhuộm Gram âm.
• Tế bào biểu mô vảy nhuộm Gram dương.

Các phương pháp nhuộm Gram khác nhau được sử dụng, chẳng hạn như nhuộm Gram Atkin, và nhuộm Gram Burke, v.v.

Chẩn đoán kết quả

Nhuộm Gram là phương pháp giúp hỗ trợ chẩn đoán bệnh hoặc tình trạng bệnh lý. Từ việc biết được loại vi khuẩn sẽ giúp chẩn đoán chính xác căn bệnh mà người bệnh đang mắc phải, giúp bác sĩ có phác đồ điều trị hợp lý, đúng đắn nhất. 

Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm màu tím pha lê (crystal violet) để nhuộm vi khuẩn, sau đó sử dụng dung dịch khử màu, nếu kết quả dương tính, vi khuẩn giữ được màu của thuốc nhuộm (màu tím) thì đó là vi khuẩn gram dương còn ngược lại kết quả âm tính, vi khuẩn không giữ được màu thuốc nhuộm (màu hồng) thì đó là vi khuẩn gram âm.

• Một số vi khuẩn bắt màu Gram dương ví dụ là: tụ cầu khuẩn, liên cầu khuẩn, vi khuẩn than,…
• Một số vi khuẩn bắt màu Gram âm như: lậu cầu, não mô cầu, vi khuẩn thương hàn, E. coli,…

Ví dụ về các sinh vật gram dương là: 

• Cocci: Các loài Staphylococcus và các loài Streptococcus
• Trực khuẩn: Loài Corynebacterium, loài Clostridium và loài Listeria

Ví dụ về các sinh vật gram âm là:

• Cocci: Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis và các loài Moraxella
• Trực khuẩn: Escherichia cuộn, loài Pseudomonas, loài Proteus và loài Klebsiella

Ví dụ về các sinh vật biến đổi gram bao gồm:

• Các loài Actinomyces

Một kết quả bình thường trong dịch cơ thể vô trùng phải là không có bất kỳ sinh vật bệnh lý nào trong vết phết. Các sinh vật được xác định dựa trên màu sắc và hình dạng.

Một số câu hỏi về vi khuẩn gram:

• Gram âm bắt màu gì? Các sinh vật Gram dương có màu tím hoặc xanh lam
• Gram dương bắt màu gì? Các sinh vật Gram âm có màu hồng hoặc đỏ
• Trực khuẩn có hình gì? Trực khuẩn có hình que
• Cầu khuẩn có hình gì? Cầu khuẩn có hình cầu

Các phát hiện trên vết nhiễm khuẩn Gram gợi ý các bệnh nhiễm trùng cơ bản:

• Cầu khuẩn Gram dương thành từng đám: Thường là đặc trưng của các loài Staphylococcus như S. aureus
• Cầu khuẩn gram dương dạng chuỗi: Thường đặc trưng cho các loài liên cầu như S. pneumoniae, liên cầu nhóm B
• Cầu khuẩn Gram dương trong bệnh uốn ván: Thường là đặc trưng của Micrococcus spp
• Trực khuẩn Gram dương, dày: Thường là đặc trưng của Clostridium spp., Như C.perfringens, C.nticum
• Trực khuẩn Gram dương, gầy: Thường đặc trưng của Listeria spp
• Trực khuẩn gram dương phân nhánh: Thường đặc trưng cho Actinomyces và Nocardia
• Song cầu khuẩn gram âm: Thường là đặc trưng của Neisseria spp., Chẳng hạn như N. meningitidis
• Coccobacilli: Thường là đặc trưng của Acinetobacter spp., Và chúng có thể là gram dương, gram âm hoặc gram biến đổi
• Trực khuẩn gram âm, gầy: Thường đặc trưng của họ Enterobacteriaceae , như E. coli
• Coccobacilli: Thường là đặc trưng của Haemophilus spp chẳng hạn như H. influenzae
• Cong: Thường là đặc trưng của Vibrio spp.; Campylobacter spp chẳng hạn như V. cholerae và C. jejuni
• Hình kim mỏng: Thường là đặc trưng của Fusobacterium spp
• Các sinh vật biến đổi Gram: những sinh vật này không phân nhóm thành sinh vật Gram dương hoặc Gram âm
• Tạii sao vi khuẩn lao không nhuộm màu Gram được?

Không phải vi khuẩn nào cũng có thể nhuộm màu Gram, trong đó có vi khuẩn lao. 

Tác nhân gây ra bệnh lao là vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis (MTB), là vi khuẩn hiếu khí. Vi khuẩn này phân chia mỗi 16 đến 20 giờ, rất chậm so với thời gian phân chia tính bằng phút của các vi khuẩn khác (trong số các vi khuẩn phân chia nhanh nhất là một chủng E. coli , có thể phân chia mỗi 20 phút). 

MTB không được phân loại Gram dương hay Gram âm vì chúng không có đặc tính hoá học này, mặc dù thành tế bào có chứa peptidoglycan. Trên mẫu nhuộm Gram, nó nhuộm Gram dương rất yếu hoặc là không biểu hiện gì cả.

Thông thường, bệnh do vi khuẩn gram âm gây ra sẽ nguy hiểm hơn so với gram dương. Nguyên nhân là do màng ngoài của vi khuẩn gram âm được bọc bởi một lớp màng. Lớp màng này khiến cho hệ thống miễn dịch của cơ thể khó phát hiện được sự xâm nhập của vi khuẩn.

Ngoài ra, lớp màng ngoài của vi khuẩn gram âm có chứa hàm lượng lipopolysaccharide cao là nội độc tố, tác nhân gây sốt, làm tăng độ nặng của phản ứng viêm, có thể gây sốc nhiễm khuẩn rất nguy hiểm.

Tuy rằng, vi khuẩn gram dương ít gây nguy hiểm hơn, nhưng bạn đừng chủ quan hay xem nhẹ nó, bởi vẫn có những loại vi khuẩn gram dương gây ra những tình trạng bệnh nghiêm trọng, nguy hiểm như viêm nội tâm mạc, nhiễm trùng huyết, viêm màng não… nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời có thể dẫn tới tử vong. 

Vi khuẩn xuất hiện, tồn tại và phát triển khắp mọi nơi trong môi trường sống của con người. Chính vì vậy, việc nhiễm vi khuẩn là điều dễ xảy ra với bất cứ ai. Mỗi loại vi khuẩn lại có cấu trúc, hình dạng, nguyên lý hoạt động khác nhau.

Chúng gây ra những căn bệnh không nhau. Việc xác định đúng loại vi khuẩn sẽ giúp bác sĩ chẩn đoán được bệnh cũng như đưa ra hướng điều trị phù hợp, chính xác, hiệu quả nhất. Một trong những phương pháp định danh vi khuẩn phải kể đến phương pháp nhuộm Gram. 

Nhuộm Gram thường là xét nghiệm chẩn đoán ban đầu để đánh giá tình trạng nhiễm trùng. Việc sử dụng phương pháp nhuộm Gram tạo điều kiện nhanh chóng cho việc sử dụng kháng sinh thích hợp. Tuy nhiên, trình tự gen và kỹ thuật phân tử đặc hiệu hơn so với nhuộm gram cổ điển.

---

Bài viết được tham khảo bác sĩ và các nguồn tư liệu đáng tin cậy trong và ngoài nước.

Bạn đọc chưa biết:

• Nhiễm liên cầu khuẩn: Phân loại, chẩn đoán và điều trị
• So sánh vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương
• Vi khuẩn gram dương và những thông tin bạn cần biết